本文是学习GB-T 34745-2017 猪圆环病毒2型 病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了SYBR GreenI实时荧光定量 PCR 检测猪圆环病毒2型的技术要求。
本标准用于检测猪圆环病毒2型核酸，适用于临床样品中猪圆环病毒2型的快速检测。
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GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
下列缩略语适用于本文件。
Ct 值：循环阈值(Cycle Threshold)
DNA: 脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid)
EDTA: 乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic Acid)
PBS:磷酸盐缓冲溶液(Phosphate Buffer Saline)
PCR: 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)
PCV2: 猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus Type 2)
PMWS: 仔猪断奶后多系统衰竭综合征(Postweaning Multisystemic Wasting
Syndrome)
Taq 酶：Taq DNA 聚合酶(Taq DNA Polymerase)
tm 值：解链温度(Melting Temperature)
除非另有规定，仅使用分析纯试剂。所有试剂均用无RNA 酶污染的容器(用DEPC
水处理后高压
灭菌)分装。
4.1 蛋白酶 K (配制见附录 A):—20 ℃保存。
4.2 裂解缓冲液(配制见附录 A):4 ℃保存。
4.3 异硫氰酸胍裂解液(配制见附录 A):4 ℃保存。
4.4 平衡酚(配制见附录 A):4 ℃保存。
4.5 酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)混合液(配制见附录A):4℃ 保存。
4.6 氯仿-异戊醇(24:1)(配制见附录 A):4℃ 保存。
4.9 70%乙醇：用新开启的无水乙醇和灭菌去离子水配制(符合GB/T
6682要求),-20℃预冷。
GB/T 34745—2017
4.10 SYBR Green PreMix荧光染料预混酶：5 U/μL,-20 ℃保存。
5.2 高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达12000 r/min 以上。
5.4 4 ℃冰箱、 -20℃冰箱和-70 ℃以下超低温冰箱。
5.5 可调微量移液器(2μL,10μL,100μL,200μL,1000μL)。
6.2 透明薄壁 PCR 管(0.2 mL)。
棉拭子、剪刀、镊子、1.5mL 离心管、研钵。以上采样工具经121℃±2℃下15 min
高压灭菌，并干
燥处理。
应采集疑似发病死猪的淋巴结、肺、脾、肝。用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品，将采集的样品装入
一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，用冰盒装运送至实验室冻存备用。
用真空采血管或无菌注射器采集发病猪的血液，分离血清及血浆，并分装至无菌离心管中，密封，编
号后保存于4℃环境中送检。
样品采集后，将采集的样品放入密闭的塑料袋内(一个采样点的样品，放入一个塑料袋内),存放于
含有冰袋的保温箱中、密封，送实验室。
取待检样品2.0 g 于已洗净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10 mL
灭菌生理盐水混匀，反复冻 融3次，3000 r/min 离心15
min,取上清液转入无菌的1.5 mL 离心管中，编号备用。血清和血浆样品
可不经特殊处理，直接用于检测。
样本在2℃~8℃条件下保存应不超过24
h,若长期保存应放在一70℃以下冰箱，应避免反复冻
GB/T 34745—2017
融(冻融不超过3次)。
取灭菌的1.5mL
离心管，分别加入被检样品、阳性样品与阴性样品，并在离心管上做标记，避免
混乱。
取 n+2 支1.5 mL 离心管，分别加入被检样本 n
个、阴性对照、阳性对照各300μL,加入等体积异
硫氰酸胍裂解液(或加入等体积样品裂解缓冲液混匀，再加入蛋白酶 K
至终浓度为200μg/mL),37℃
水浴60 min(或55℃水浴30 min),然后加入等体积的平衡酚，混匀器上振荡混匀5
s(不能过于强烈， 以免产生乳化层，也可以用手颠倒混匀)。于12000 r/min
离心10 min。 取上清液，分别加入等体积的
酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)、氯仿-异戊醇(24:1)、氯仿进行抽提。
取1.5 mL
离心管，吸取各管中的上清液转移至相应的管中，不能吸出中间层，加入2倍体积异丙
醇，放置-20℃沉淀60 min 或-70℃沉淀30 min。
于12000 r/min 离心5 min
(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置),小心弃去上清液，倒置于吸
水纸上，沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干);加入600 μL70%
乙醇，颠倒洗涤两次。
于12000 r/min 离心5 min
(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置),小心倒去上清液，倒置于吸
水纸上，尽量沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干)。自然风干。
加入20 μL 灭菌去离子水，轻轻混匀，溶解管壁上的DNA,12000
长期保存应放置于-70℃冰箱。
r/min 离心30 s,冰上保存备用。
8.2.1 荧光定量 PCR 反应体系的配制
在反应混合物配制区进行。从试剂保存盒中取出上游引物 P1、下游引物 P2、SYBR
Green PreMix, 灭菌超纯水，在室温下融化后，3000 r/min 离心5 s。设定PCR
数为 n+2, 其中n 为待检样品
数， 一管阳性对照及一管阴性对照，每个样本测试反应体系配制(见附录B)。
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积的离心管中，向其中加入12.5μL×n 的
SYBR Green PreMix,0.5μL×n 的上游引物 P1,0.5μL×n 的下游引物 P2,10.5μL×n
的灭菌去离子水并充分混合
均匀。向每个定量 PCR 管中各分装24μL,转移至样本处理区。
在样本处理区进行。在各设定的定量 PCR 管中分别加入7.2中制备的未知样本
DNA 溶液各
1μL, 盖紧管盖后，500 r/min 离心30 s。
8.2.3 荧光定量 PCR 扩增反应
在样本检测区进行。将本标准7.3.2中加样后的PCR 管放入荧光PCR
检测仪内，记录样本摆放顺
序。在96孔板内记录或填写被检样品、阳性对照、阴性对照。
GB/T 34745—2017
设定 SYBR GreenI实时荧光定量PCR 检测猪圆环病毒2型的反应参数(见附录B)。
试验检测结
束后，根据收集的荧光曲线和Ct 值判定结果。
直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品
扩增曲线的最高点为准。
无Ct 值并且无扩增曲线。
Ct
值应≤30.0,并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。读取检测结果，阈值设定原则
以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点的结果显示阴性为准，或可根据仪器噪声情况进
行调整。
无Ct 值并且无扩增曲线，判为阴性，表示样品中无猪圆环病毒2型病毒。
Ct
值≤30.0,且出现典型的扩增曲线，判为阳性，表示样品中存在猪圆环病毒2型病毒。
Ct 值>30.0,且具有扩增曲线的样品建议重做。重做结果无Ct
值者为阴性，否则为阳性。
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(规范性附录)
相关试剂的配制
A.1 磷酸盐缓冲生理盐水(PBS) 配方
A.1.1 0.2 mol/L 磷酸二氢钠水溶液：称取27.6 g 磷酸二氢钠(NaH₂PO₄
·H₂O), 先用适量蒸馏水溶
解，最后稀释至1000 mL。
A.1.2 0.2 mol/L 磷酸氢二钠水溶液：称取53.6 g 磷酸氢二钠(Na₂HPO₄
·7H₂O) ( 或 Na₂HPO₄ ·
12H2O71.6g 或 Na2HPO₄ ·2H2O35.6 g),先用适量蒸馏水溶解，最后稀释至1000
mL。
A.1.3 0.01 mol/L 、pH7.2 磷酸盐缓冲生理盐水(PBS) 的配制：取0.2 mol/L
磷酸二氢钠水溶液14 mL, 0.2 mol/L磷酸氢二钠水溶液36 mL, 加氯化钠(NaCl)8.5
g,用蒸馏水稀释至1000 mL。 经 1 2 1 ℃
15 min 高压灭菌，冷却后，无菌条件下按每毫升加入1000 IU 青霉素、1000 μg
链霉素。
A.2 裂解缓冲液
取0.02 mol/L 三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)(pH7.5),0.03
mol/L乙二胺四乙酸(EDTA), 加适量
蒸馏水溶解，再加入十二烷基硫酸钠(SDS)
至终浓度为1%,慢速搅拌至溶解，最后定容至1000 mL。
A.3 20 mg/mL 蛋白酶 K
20 mg蛋白酶 K, 加入灭菌水1 mL。
A.4 异硫氰酸胍裂解液
59.08 g异硫氰酸胍，10 mL0.5 mol/L Tris-HCl(pH6.4),10 mL0.2 mol/L
EDTA(pH8.0),再 加
灭菌水定容到100 mL。
A.5 平衡酚
从-20℃冰冻室中取出经过液化的酚，温度升至室温后，68℃水浴加热使酚溶解，加入羟基喹啉
至终浓度为0.1%。加入等体积0.5 mol/LTris-HCl(pH8.0)
的缓冲液，用磁力搅拌15 min, 待两相分
开后，尽可能彻底地移除上层水相液。加入等体积0.1 mol/L
Tris-HCl(pH8.0)到酚中，搅拌15 min,
待两相分开后，尽可能彻底地移除上层水相液。重复抽提，直到酚相pH 大于7.8。
A.6 酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)混合液
将平衡酚、氯仿和异戊醇按体积比25:24:1混合，搅拌均匀。
A.7 氯仿-异戊醇(24:1)
将氯仿和异戊醇按体积比24:1混合，搅拌均匀。
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(规范性附录)
荧光定量 PCR 检测用引物、反应条件及注意事项
B.1 猪圆环病毒2型 SYBR
猪圆环病毒2型 SYBR
GreenI实时荧光定量 PCR 检测用引物
GreenI实时荧光定量 PCR 检测用引物见表 B.1。
表 B.1 设计引物序列
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引物浓度均为20 pmol/μL。
引物的tm 值在58℃~62℃之间，并且上下游引物的tm 值不能差别太大。
引物的GC 含量在40%～60%之间，45%～55%最佳。
B.2 猪圆环病毒2型 SYBR GreenI 实时荧光定量 PCR
反应体系
猪圆环病毒2型 SYBR GreenI实时荧光定量 PCR 反应体系试剂配制见表 B.2。
表 B.2 测试反应体系配制表
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10.5 μL |
B.3 猪圆环病毒2型 SYBR GreenI实时荧光定量 PCR
反应参数
设定 SYBR GreenI 实时荧光定量 PCR 检测猪圆环病毒2型的反应参数。
第一阶段，预变性95℃/3 min。
第二阶段，95℃/15 s,55℃/15s,72℃/15
s,40个循环；荧光信号的收集设置在第二阶段每次循
环的退火延伸时进行，以获得样本的扩增动力学曲线。
第三阶段，反应结束后先加热至95℃,然后再降至60℃,开始以0.5℃/s
递增至95℃检测荧光信
号得出扩增产物的溶解曲线。
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B.4 使用时的注意事项
在检测过程中，应严防不同样品间的交叉污染。
反应液分装时应避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。
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